Исследование влияния фосфороорганического соединения Мелафена на рост и энергетические процессы клеток хлореллы
Изучение влияния фосфор органического препарата мелафена на роста и энергетические процессы одноклеточной зеленой водоросли хлореллы. Объектом исследования являлась водоросль Chlorella vulgaris. Выяснение механизмов ростстимулирующего эффекта мелафена показало, как и ожидалось с позиции передачи сигнала, что он обусловлен активацией энергетических процессов, в частности, дыхания и фотосинтеза, причем препарат в большей степени оказывал влияние на циклическое фотофосфорилирование. При этом увеличивалась и общая скорость теплопродукции, характеризующая эффективность использования энергии клеткой. Полученные результаты на культуре клеток хлореллы позволили сделать заключение, что мелафен, обладая высокой полифункциональной физиологической активностью в низких концентрациях, может быть рекомендован в качестве регулятора роста растений, отвечающий современным требованиям технологий для испытания на ведущих сельскохозяйственных культурах.
Введение
В течение последних нескольких десятилетий уделяется большое внимание изучению механизмов действия природных фитогормонов и их синтетических аналогов, поскольку этим соединениям принадлежит ключевая роль в регуляции жизни растений на всех этапах их онтогенеза. Уже создано и изучено в той или иной мере свыше нескольких тысяч соединений химического, микробного и растительного происхождения, обладающих регуляторным действием.
Использование регуляторов роста является одним из наиболее эффективных путей повышения урожайности, качества сельскохозяйственных культур, а также их устойчивости к воздействию неблагоприятных условий окружающей среды. В настоящее время достигнуты большие успехи в понимании метаболизма фитогормонов и в выяснении молекулярного механизма их регуляторного действия.
Изучение механизмов действия фитогормонов крайне важно не только для понимания их роли в осуществлении регуляции физиологических процессов в растительных организмах на протяжении всего онтогенеза, но и с точки зрения практического применения в растениеводстве. Однако существует ряд трудностей по применению фитогормонов в растениеводстве, так как получение и очистка их от примесей являются дорогостоящими процессами, что делает экономически невыгодным использование их на практике. Кроме того, как правило, они нестойки и легко разрушаются под действием различных факторов, что снижает их биологическую активность.
С этой целью проводится синтез и отбор эффективных аналогов природных фитогормонов с заданными свойствами, повышающих интенсивность ростовых процессов растений и устойчивость их к разнообразным стрессовым воздействиям, и, следовательно, увеличивающих общую продуктивность растений.
Идея использования соединений подобных фитогормонам в качестве регуляторов роста привела к массовому поиску синтетических препаратов аналогичного действия, использование которых в ничтожно малых концентрациях активировало бы запуск физиолого-генетических программ, приводящих к интенсификации важнейших физиологических процессов и, как результат, обеспечивало бы повышение урожайности, улучшение товарного качества продукции. С другой стороны, эти физиологически активные соединения должны быть безопасными для здоровья человека и окружающей среды. Поэтому поиск высокоэффективных нетоксичных соединений и исследование их действия исключительно актуальны. Целью работы явилось изучение влияния мелафена на рост и энергетические процессы одноклеточной зеленой водоросли Chlorella vulgaris.
Методика
Объектом исследования являлась одноклеточная водоросль Chlorella vulgaris. Широкое использование этого объекта для тестирования физиологической активности новых соединений объясняется тем, что этот одноклеточный организм имеет хорошо сформированные органоиды подобно высшим растениям. Детально изучены структурно-функциональные, генетические особенности клеток хлореллы и их чувствительность к химическим и физическим воздействиям.
Хлореллу выращивали в культуральных сосудах в условиях равномерной культуры в среде Тамийя при температуре 30°С и барботировании воздухом, содержащимо 3% С02. Освещенность на поверхности сосудов, обращенных к лампам дневного света, составляла 10 тыс. люкс, фотопериод - 12 ч.
Для измерения плотности суспензии клеток хлореллы использовался концентрационный фотоколориметр (КФК-2МП). Длина волны - 670 нм, толщина кюветы - 1 мм. Параллельно с измерением на фотоколориметре подсчитывали измеряемые плотности под микроскопом в камере Гаряева. На основании полученных данных строили градуировочную кривую, где ось абсцисс - это количество клеток (млн/мл), ось ординат - соответствующие плотности суспензии клеток хлореллы, измеренные на фотоколориметре.
Для определения сухого веса суспензию хлореллы центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об/мин. Осадок переносили в бюксы, предварительно доведенные до постоянного веса. Бюксы помещали в сушильный шкаф при t=105°C и доводили до постоянного веса. Сухой вес 100 млн. клеток хлореллы - используемого нами штамма - был равен 0,7 мг.
При использовании калориметрического метода в сочетании с методами определения скоростей газообмена при фотосинтезе и дыхании можно получить объективную информацию об изменении энергетических и метаболических процессов в растительных клетках.
Скорость фотосинтеза и дыхания измеряли полярографическим методом, используя полярограф ОН-105 (Radelkis, Budapest). Полярографический метод изучения биологического окисления основан на амперометрическом определении поглощенного кислорода. Изменение концентрации кислорода в ячейке оказывает влияние на скорость электрохимического восстановления кислорода и, вследствие этого, на величину силы тока. Последнее приводит к изменению характера зависимости между силой тока и приложенным напряжением, что отражается на характере полярограмм (величина угла наклона). Таким образом, по углу наклона полярографических кривых можно рассчитывать количество поглощенного кислорода в единицу времени, то есть скорость дыхания или же выделенного кислорода, то есть скорость фотосинтеза изучаемых объектов.
Скорость тепловыделения измеряли с помощью калориметра LKB-2277-201 (Швеция), который относится к типу теплопроводящих калориметров Тиана-Кальве, т.е. основная часть теплоты (порядка 99%), выделяющейся в калориметрическом сосуде, рассеивается в массивном метаболическом блоке, и лишь около 1% теплоты остается в сосуде, незначительно повышая температуру его содержимого. Действие микрокацориметра основано на измерении величины интегрального потока, идущего от ампулы с исследуемым объектом через дифференциально включенные термобатареи к блоку калориметра. Температура водяной бани поддерживалась с точностью 0,0004°С и регулировалась от 0° до 80°С. Чувствительность блока - 0,15 мВ. Измерения проводили в стеклянных ампулах объемом 3 мл. В измерительную ампулу загружали 1 мл суспенци хлореллы фиксированной плотности, в контрольную - 1 мл среды Iamija. Ампулу термостатировали 15-20 мин, после чего опускали в измерительный блок калориметра. Рабочая температура была 30°С. В ходе опыта регистрировали не общее количество тепла (Q), а тепловую мощность (W), характеризующую скорость выделения тепла: W = flQ/flt.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили путем определения средних арифметических и их стандартных ошибок, а также достоверности разницы между вариантами при уровне значимости Р 0,05. На рисунках приведены средние арифметические величины и их стандартные ошибки. Биологическая повторность опытов 3-5-кратная.
Результаты и обсуждение
Одним из наиболее чувствительных процессов в интегральном ответе растительных организмов на любые воздействия является рост. Рост хлореллы характеризуется плотностью суспензии, которая коррелирует со скоростью развития и деления клеток. Размеры клеток хлореллы, как правило, не превышают 10-12 мкм. Размножается эта одноклеточная водоросль только автоспорами. В одной материнской клетке образуется, как правило, четное число одинаковых по размеру автоспор. Для Chlorella vulgaris характерно 4-8 автоспор. В первую очередь необходимо было выявить концентрационную зависимость роста клеток хлореллы при дей ствии препарата. Испытывали действие мелафена в широком диапазоне концентраций от 3*10-6 до 3*10-10М.
Как видно из рис.1, мелафен наиболее эффективно влияет на рост культуры водоросли в концентрации 3*10-8 до 3*10-10М. Препарат в концент рации 3*10-6M оказывал ингибирующее действие на рост суспензии. Цикл развития клеток хлореллы - 24 ч. И как видно из рисунка, при концентра ции 3*10-8плотность хлореллы через 1 сутки после добавления мелафена увеличилась на 17% по сравнению с контролем. В дальнейшей ра боте использовались, в основном, концентрации мелафена 3*10-6 - 3*10-10М.
Поскольку рост является энергозависимым процессом, а мелафен имеет в своей структуре фосфорную группу, способную взаимодействовать с различными биомишенями, была проведена серия работ, в которой сравнивалось влияние мелафена и АТФ при равных концентрациях на рост культуры.
На рис. 2 представлены данные о влиянии мелафена и АТФ на скорость роста суспензии хлореллы. Как видно из графика, скорости роста клеток хлореллы были близки и при действии мелафена в концентрации 3*10-8 до 3*10-9М, и при действии АТФ в концентрации 3*10-9М. Увеличение плотности клеток культуры при действии концентраций мелафена 3*10-8М - 3*10-9М было сравнимо с предыдущей серией экспериментов: на 19-21% по отношению к контролю.
Наши многочисленные экспериментальные данные показали четкое стимулирующее влияние препарата на рост и развитие культуры. Абсолютные значения величин стимуляции роста мелафеном могли колебать ся, что зависело от многих причин и, в первую очередь, от физиологи ческого состояния культуры (исходной плотности и т.д.), но всегда со хранялось превышение скорости роста при действии препарата по сравнению с контролем.
Известно, что АТФ выполняет субстратную функцию в живой клетке, поставляя энергию для активного транспорта молекул и ионов, биосинтеза макромолекул и др. В настоящее время убедительно показано, что АТФ играет не только субстратную роль, но и в очень малых концен трациях выполняет сигнальную функцию, усиливая передачу сигналов через рецепторы АТФ на внешней мембране клеток, в частности, сигналов к росту и делению.
Запуск генетических программ, как показано в литературе, может осуществляться специфическими химическими и физико-химическими факторами. Вполне возможно, что мелафен относится к тем специфическим химическим факторам, способным в сверхнизких концентрациях регулировать рост растительной клетки. Можно предположить, что мелафен действует подобно АТФ при контакте с внешней мембраной растительных клеток и вызывает усиление роста и деления.
Убедительным доказательством такого предположения являются данные о влиянии различных концентраций мелафена на величину удельного тирозинового фосфорилирования белков растений. Авторы приходят к заключению, что «изменение удельного тирозинового фосфорилирова ния белков мелафеном свидетельствует о его высокой эффективности в регуляции метаболизма клеток растений тирозинкиназной сигнальной системой». Найдено, что тирозиновое фосфорилирование белков участву ет в процессах роста и дифференцировки клеток животных.
В связи с изложенным выше мы полагаем, что эффекты низких концентраций мелафена, которые мы использовали в наших экспериментах, могли быть вызваны активацией сигнальных систем клеток растений.
В клетке in vivo могут наблюдаться также ситуации, когда небольшие молекулы в критически ограниченных количествах недостаточны для использования в качестве субстрата, но могут иметь значения для «запуска» каскадного механизма усиления биологических сигналов [9]. Такой механизм требует затрат энергии. В связи с этим следующим этапом исследования явилось изучение влияния мелафена на скорость энергетических процессов растительной клетки. У фотосинтезирующих организмов увеличение общей и свободной энергии связано с фотосинтезом, который составляет основу энергетического цикла, так как именно этот процесс служит первичным источником энергии.
На рис. 3 показано изменение скорости фотосинтеза при действии мелафена и АТФ. Как видно из рисунка, мелафен в концентрации 3*10-9М оказывал существенное влияние на скорость фотосинтеза, увеличивая скорость выделения кислорода до 34%. Необходимо отметить и то, что эффект стимуляции скорости фотосинтеза сохранялся в течение длитель ного времени, практически, в течение всего онтогенетического развития клеток водоросли.
Интересен тот факт, что мелафен, как и АТФ, в одинаковой концентрации оказывал практически одинаковое воздействие на этот процесс. Результаты этих экспериментов дают весомое основание предполагать инициирующую роль фосфиновой группы молекулы мелафена подобно фосфорным группам молекулы АТФ для «запуска» каскадного механизма усиления биологического сигнала.
Как известно, в интактных ассимилирующих клетках одновременно функционируют I и II фотосистемы и связанные с ними ЦФФ и НЦФФ. следующий этап работы связан с выяснением действия мелафена на эти фотосистемы. Для разделения циклического и нециклического потока электронов и связанных с ними соответствующих типов фотофосфори-лирования широко используются ингибиторы избирательного действия. В качестве селективного ингибитора ФСИ в большинстве исследований фотосинтетического метаболизма и энергетики используют диурон. Ди-урон блокирует поток электронов от воды к НАДФ и, следовательно, тормозит НЦФФ. Центром действия производных мочевины является звено ЭТЦ между Q-первичным акцептором ФСИ и включением в цепь пластохинонов, в результате чего происходит окисление пластохинонового пула [4]. Ингибитором ФСI служит в большинстве случаев антимицин А, дсйствующий непосредственно на переносчики электронов. Предполагается, что место действия ингибитора находится между цит.b6 и цит.bf [1].
Как видно из рис. 4, мелафен в концентрации 3*10-9М стимулировал процесс фотосинтеза по сравнению с контролем, но в меньшей степени, чем в предыдущих опытах (из-за разной плотности суспензии водоросли). Диурон на 28% подавлял скорость фотосинтеза. При совместном действии мелафена и диурона степень ингибирования НЦФФ была на уровне действия только одного ингибитора, и почти не изменялась в те чение всего эксперимента (12 ч). Это дает основание предполагать, что мелафен не оказывал влияния на НЦФФ.
На рис. 5 показаны результаты влияния антимицина А (1*10-7М) и мелафена (3*10-9М) на скорость фотосинтеза. Ингибитор ЦФФ подавлял процесс фотосинтеза на 20%. Мелафен же в течение всего эксперимента оказывал стимулирующее действие на скорость выделения кислорода (на 30%) после 24 ч воздействия по сравнению с контролем. При совместном действии регулятора роста и ингибитора происходило снятие (до 13%) ингибирующего влияния антимицина А, продолжающееся в течение длительного времени. Эти результаты позволяют говорить о том, что мелафен оказывает бьльшее положительное действие на циклический тип фотофосфорилирования. Увеличение скорости ЦФФ приводит к созданию большого пула фосфорилированных интермедиатов цикла Кальвина и способствует более интенсивной работе белков хлоропластов. Как известно, ЦФФ является более резистентным к действию неблагоприятных условий среды [3; 13; 16]. По-видимому, можно прогнозировать антистрессовое действие мелафена.
Дыхание является основным источником энергии для эндоэргонически протекающих процессов жизнедеятельности растений. В связи с этим значительный интерес представляло изучение влияния мелафена на скорость дыхания клеток хлореллы.
На рис. 6 представлены данные о скорости поглощения кислорода растительными клетками. Наблюдалась стимуляция скорости дыхания хлореллы при действии мелафена по сравнению с контролем. Степень стимуляции поглощения кислорода зависела от концентрации мелафена. Так, при концентрации мелафена З*10-8М интенсивность дыхания увеличивалась на 4%, а при концентрации мелафена З*10-9М - на 18% к 4 ч воздействия. Через 12 ч разница была больше - на 14% и 21%, соответственно.
Можно предположить, что мелафен влияет на активность работы дыхательной ЭТЦ через сигнальные системы. Такое предположение основывается на результатах экспериментов (рис. 7) по влиянию препарата и ингибитора антимицина А на скорость поглощения кислорода [4; 5]. Ингибирование митохондриального окисления антимицином А вызывало уменьшение потребления кислорода на 23% после 12 ч воздействия по сравнению с контролем. Мелафен оказывал существенное влияние на скорость дыхания клеток хлореллы: стимуляция за 2 ч составляла 17%, за 4 ч - 31%, за 12 ч - 29%. Подавление скорости поглощения в этих условиях связано с нарушением основной функции митохондрий - работой ферментов электронного транспорта, сопряженного с окислительным фосфорилированием. При совместном действии мелафена и антимицина A, как видно из рис. 7, происходило подавление скорости дыхания (на 13%), стимулированного действием только одного мелафена. Этот результат является убедительным доказательством, что мелафен влияет именно на митохондриальное дыхание клеток хлореллы.
Наше заключение о регуляторном влиянии мелафена на митохондриальное дыхание растительных клеток было подтверждено результатами опытов на выделенных митохондриях корнеплодов сахарной свеклы, которые были проведены в Институте биохимической физики РАН (г. Москва) под руководством д.х.н. Бурлаковой Е.Б. [6]. Авторами было показано, что мелафен в концентрации 4*10-12М увеличивал эффективность окислительного фосфорилирования дыхательной цепью митохондрий сахарной свеклы на 20% при окислении NAD-зависимых субстратов. В концентрации 4*10-9М препарат увеличивал скорость переноса электронов на 33-47%.
Итак, экспериментально показано, что мелафен оказывает значительное влияние на увеличение скорости энергетических процессов, как фотосинтеза, так и дыхания. Об эффективности использования энергии можно судить по скорости теплопродукции растительными клетками.
Следующая серия экспериментов была связана с измерением скорости теплопродукции клетками хлореллы при действии мелафена в концентрациях (З*10-8 и З*10-9). Выделение метаболического тепла является интегральным показателем физиологического состояния растительной клетки, так как отражает взаимодействие всех функциональных систем организма, все изменения связанные с анаболическими и катаболическими процессами в клетках. Именно скорость теплопродукции характеризует эффективность использования энергии, являясь мерой потери энергии из тканей в среду [8; 19]. Исходя из того, что мелафен существенно увеличивал скорость роста, фотосинтеза и дыхания хлореллы, можно было предположить, что скорость теплопродукции в опытном варианте будет выше контрольной.
На рис. 8 показано изменение скорости теплопродукции суспензии члореллы при добавлении в среду выращивания мелафена разной концентрации (З*10-8 - З*10-9). Как видно из рисунка, скорость тепловыделения в вариантах с мелафеном остается выше контроля на всем протяжении опыта и зависела от концентрации мелафена: при концентрации З*10-8 М - на 50%, при концентрации З*10-9 - на 70% за 1 ч, на 45% и 70% за 2 ч, и 25% и 56% за 3 ч, соответственно. Анализ полученных результа тов позволяет сделать вывод о положительном влиянии препарата на энергетический баланс растительных клеток. Дополнительная энергия, образованная при триггерном действии мелафена на клетку, является осно вой ускорения метаболических процессов клеток хлореллы, что, в свою очередь, отражается на скорости роста культуры.
Заключение
Проведенные нами исследования действия мелафена показали, что данный препарат в низких концентрациях З*10-8—З*10-10М) активирует ростовые процессы в суспензионной культуре клеток хлореллы; анало гичный эффект наблюдался и под влиянием АТФ в той же концентрации.
Для объяснения механизмов ответных реакций клеток хлореллы на действие мелафена в низкой концентрации можно привлечь передачи информации через сигнальные системы клеток, которые с помощью рецепторов на мембранах могут усиливать действие сигнальной молекулы в 100-1000 раз, вызывая адекватный клеточный ответ. Данные литературы указывают, что мелафен в концентрации 10-6-10-8М изменял уровень фосфорилирования белков листьев гороха, что свидетельствует о включении сигнальных систем в механизм действия мелафена [2]. Известно, что сигнальные системы контролируют динамику реализации клеточного ответа на стресс. Динамика клеточного ответа включает взаимодействие различных сигнальных систем, влияющих на величину фосфорилирования белков, направленное на выживание организма и/или оптимизацию его метаболизма. Авторы полагают, что изменение удельного гирозинового фосфорилирования белков мелафеном свидетельствует о его высокой эффективности в регуляции метаболизма клеток растений гирозинкиназной сигнальной системой.
Мелафен в нашей работе использовался в низких концентрациях (З*10-8-З*10-10М), что указывает на невозможность его использования как субстрата. По своему действию мелафен «сходен» с АТФ, рецепторы ко торого найдены в клетках животных. Возможно, что в растительных клет ках также существуют рецепторы АТФ, которые могут связываться с мелафеном. Рецепторы АТФ в клетках животных сопрягаются с аденилатцикклазной сигнальной системой и оказывают эффект на регуляцию взаи модействия сети сигнальных систем.
Выяснение механизмов ростстимулирующего эффекта мелафена показало, как и ожидалось с позиции передачи сигнала, что он обусловлен активацией энергетических процессов, в частности, дыхания и фотосинтеза, причем препарат в большей степени оказывал влияние на циклическое фотофосфорилирование. При этом увеличивалась и общая скорость теплопродукции, характеризующая эффективность использования энергии клеткой. Полученные результаты на культуре клеток хлореллы позволили сделать заключение, что мелафен, обладая высокой полифункциональной физиологической активностью в низких концентрациях, может быть рекомендован в качестве регулятора роста растений, отвечающий современным требованиям технологий для испытания на ведущих сельскохозяйственных культурах.